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对于无参物种或参考基因组不完善的物种，想要开展基因调控机制研究，往往在进行转录组测序后，将得到的数据与近缘种的参考基因组比对，或借助Trinity拼接成Unigenes后与NR、Swissprout、KEGG等公共数据库完成基因定性。然而，在物种的演化进程中，即便属于同属物种，其基因组也存在一定的差异性。尤其在“种”的选育培育过程，其基因组组成已朝着人类选择的方向改变。因此，对优良“种”的基因组测序，不仅可了解其与其他品种的基因组成上的差异，还为优良种的特异优势表型提供分子基础。辅以代谢组，了解表型差异的分子特征，同时借助转录组将基因在转录层面的差异表达与代谢（表型）层面的分子响应进行关联，可直接筛选出调控优势性状的重要基因及其调控机制。
今天跟大家分享一篇发表在《 Frontiers in Plant Science 》上，研究腺枝葡萄GH6酚类化合物合成和积累的文章。文章中作者借助基因组测序获得完整的GH6叶片基因组信息并利用广泛靶向代谢组筛选在GH6中丰度更高的酚类相关化合物。最后开展转录组测序，根据基因转录水平的差异，筛选调控酚类物质在不同葡萄品种中差异积累的关键基因。实现 功能基因→基因转录调控→代谢产物的贯穿性研究，同时完善的基因组信息也为GH6其它优良品质研究及今后的遗传改良提供了重要依据。
发表时间：2023年1月
发表期刊：Frontiers in Plant Science
IF：6.627
合作单位：广西农业科学院葡萄与葡萄酒研究所
发表时间：2023年1月
发表期刊：Frontiers in Plant Science
IF：6.627
合作单位：广西农业科学院葡萄与葡萄酒研究所
研究背景与目的
野生葡萄中的腺枝葡萄（ Vitis adenoclada ）因其对高温、潮湿、真菌病虫害、干旱、土壤贫瘠具备较高的耐受性，已成为广西当地重要的酿酒原材料。酚类（Phenolics）物质是影响葡萄感官品质的重要化合物，进而会影响葡萄酒的口感。研究表明，酚类物质的合成和浓度受基因调控等影响。了解葡萄的基因组信息为揭示其品质研究具有重要意义。 本研究主要目的，即借助基因组揭示野生腺枝葡萄GH6（ Vitis adenoclada ）的基因组信息，并结合转录组、代谢组，探索野生葡萄中调控酚类合成和浓度的关键基因， 助力葡萄的品质研究。
实验设计
（1）取材：
选择赤霞珠（ V. vinifera , CS）、马瑟兰（ V. vinifera , Mar）、味而多（ V. vinifera , PV）、凌丰NW196（V. heyneana × V. vinifera）、Yeniang No.2,（ V. adenoclada , YN2）桂黑珍珠4号（ V. adenoclada , GH4）、桂黑珍珠5号（ V. adenoclada , GH5）、桂黑珍珠6号（ V. adenoclada , GH6）共8个葡萄品种为本次研究材料。
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（2）组学研究：
理化指标分析：分别测量8种葡萄浆果的鲜重、pH值、总可溶性固形物（TSS）、可滴定酸度（TA），每组3个生物学重复；
基因组：收集新鲜的GH6嫩叶进行基因组研究；
转录组：分别收集8种浆果进行RNA-seq，每组3个生物学重复。
代谢组：样本类型同转录组。
研究思路
研究结果
1. 基因组检测结果的整体描述
基于Illumina测序得到的数据进行K-mer分析，发现GH6基因组大小约为524.23Mb，含有0.62%的杂合度和49.18%的重复序列。ONT测序总共生成了103.24 Gb的原始数据，质控后共获得94.99 Gb的clean reads。对clean reads进行Nanopore组装和校准，获得GH6的基因组草图大小约为498.21Mb，conting N50长2.91Mb。
为进一步获取GH6基因组中的染色体信息，通过Hi-C辅助组装技术将481.44Mb序列组装挂载到19条假染色体上，N50为25.26Mb（图1）。CEGMA和BUSCO分析表明基因组组装质量和完整性较高（表1）。结合转录因子数据库、GO、KEGG、KOG、TrEMBL、NR数据库对基因组进行注释，发现498.27Mb基因组包含221.78Mb转座元件，28660个蛋白质编码基因。
图1 腺枝葡萄GH6品种基因组草图
表1 CEGMA和BUSCO分析GH6基因组组装质量和完整度
对GH6（ V. adenoclada ）、PN40024（ V. vinifera ）、光荣（ V. riparia ）、Trayshed（ V. rotundifolia ）、红枣（ Ziziphus jujuba ）、苹果（ Malus domestica ）、猕猴桃（ Oryza sativa ）、无油樟（ Amborella trichopoda ）、拟南芥（ Arabidopsis thaliana ）共10个物种的基因组数据整合分析。 韦恩图结果表明，与PN40024、光荣、Trayshed葡萄品种相比，有475个基因在GH6中特异性表达（图2B）。利用从10个物种中共鉴定出的417个保守单拷贝直系同源基因构建系统发育树，发现腺枝葡萄（ V. adenoclada ）与葡萄（ V. vinifera ）距离更紧密，两者与光荣（ V. riparia ），Trayshed（ V. rotundifolia ）处同一分支上。同时，在GH6（ V. adenoclada ）的形成过程中扩展了223个基因家族，主要与植物的防御过程有关，暗示GH6基因家族的扩增可助力其抵抗疾病（图2C）。 基因组共线性分析表明，GH6与PN40024、光荣、Trayshed间具有高度的基因秩序性和位点保守性且GH6中第7号染色体与光荣第7号染色体，第二十号染色体存在线性相关（图2D）。
图2 GH6基因组与其它代表性植物的比较基因组学分析
*A：10个物种的基因组基因种类及数量分析；B：四个葡萄变种的基因家族韦恩图；C：10个物种系统发育树；D：四个葡萄变种的基因组共线性示意图
2. 腺枝葡萄GH6代谢物特征与其他品种存在差异，其主要富含酚类、黄酮醇类、水杨酸类等物质
上文提到，酚类物质是影响腺枝葡萄GH6品质的重要候选代谢物，是本研究重点关注的代谢物之一。为比较酚类种类和浓度在不同品种间的差异，作者借助广泛靶向代谢组对8个品种的葡萄进行检测。结果表明，代谢组检测获得674种代谢物，并根据丰度差异可将代谢物划分为两大类型（图3A）。主成分分析和聚类树结果表明，GH6和YN2具有相似的代谢物特征，8个品种的葡萄浆果的代谢特征存在一定差异（图3B，C）。
图3 8个品种的葡萄浆果的代谢物特征
*A：代谢物聚类热图，展示代谢物在不同样本中的丰度差异；B：样本PCA分析，展示样本代谢物特征的相似性；C：样本聚类树，描述样本与样本间的距离，也可表明样本的相似性
K-means聚类将674种代谢物划分成12个亚类，其中第8和第10亚类中有42种代谢物在腺枝葡萄中的丰度更高，其主要为类黄酮、酚类物质（图4A）。相比于其他品种，GH6更富含酚酸类（phenolic acids）、水杨酸类（salicylic acid）、白藜芦醇（resveratrol）、白藜芦醇苷（piceid）、槲皮素（quercetins）、杨梅素（myricetins）、山萘酚（kaempferols）等物质。
图4 8个葡萄品种浆果代谢物特征分析
*A：饼图，描述第8亚类，第10亚类中42种代谢物组成占比；B：饼图，描述第8亚类，第10亚类中31种代谢物组成占比；C：热图，分析8种葡萄浆果中代谢物含量差异；
3. 调控酚类物质合成和浓度的转录过程
酚类化合物差异积累是否与上游基因调控有关？随即作者借助RNA-seq，将获得的数据与自测基因组比对并使用DESeq2进行差异分析，按照|log 2 FC|≥1，FDR＜0.05为阈值筛选出13,423个差异表达基因。对参与苯丙醇/类黄酮生物合成途径相关的基因转录过程进行分析，发现编码苯丙烷代谢途径上游酶的基因，如： PAL (EC:4.3.1.24)、 C4H (EC:1.14.13.11)、 STS (EC 2.3.1.74)在PV、NW96、YN2、GH6品种中的丰度更高。 COMT (EC 2.3.1.74)、 FLS 、 LAR (EC 5.5.1.6)、 ANR (EC:1.3.1.77)、 UFGT (EC 2.4.1.11.5)在腺枝葡萄的四个变种中丰度更高（图5）。
图5 酚类合成相关差异表达基因-酚类化合物通路示意图
*注：红色表示高表达，绿色表示低表达。
研究表明转录因子（TF）对基因的表达和酚类物质的合成也具备调控作用。作者借助植物转录因子数据库注释到1442个转录因子，通过计算转录因子与基因丰度的Pearson相关系数，共筛选到PALs，COMT，STSs，CHSs，UFGT 5种与TF关联最强的酚类合成相关基因，这些基因主要与MYB、ERF、bHLH、GRAS、NAC、WRKY、C2H2Z转录因子家族显著正相关，具有较高的共表达（图6），暗示这些TFs是调控酚类代谢物相关基因上调的重要原因。
图6 转录因子对酚类化合物合成相关基因共表达网络图
*注：绿色为转录因子（转录酶），蓝色为酚类合成相关基因
图7 差异基因WGCNA分析
*A：差异基因相关性聚类分析；B：模块—酚类化合物相关性分析；C：关键模块内基因GO富集分析
为直接揭示葡萄品质形成过程中基因与代谢物的关联，使用比较组中的所有差异表达并过滤掉其中在50%以上的样本中FPKM＜0.8的基因进行WGCNA分析，共获得9个模块（图7A）。计算模块特征值与酚类化合物丰度的相关系数，发现lavenderblush模块内的基因与咖啡酸、阿魏酸、水杨酸、显著正相关。navajowhite，tan模块与黄烷-3-醇和部分花青素显著正相关。cyan模块主要与二苯乙烯和杨梅素显著正相关。其中调空酚类合成的相关基因STS主要在darkslateblue模块中（图7B）。
对模块内的基因进行转录因子注释，发现lavenderblush模块中有93种TFs，其中有8类TFs（ERF5、ARF19、MYB2、BLH9、WRKY28、GLK1、MYB73-1、MYB73-2）与COMT（酚类合成相关基因）显著正相关，暗示这些TFs可涉及阿魏酸的合成。在cyan模块内共注释到315个TFs，其中有6类TFs（ARF2A、BLH7、HOX16、LRP1、MYB12、UFGT）与FLS显著相关，有6类TFs（ZFP2、WRKY44、MYB12、ARF2A、HOX22、LRP1）与UFGT显著相关，说明这些TFs可涉及黄酮醇和花青素的合成。
文章小结
通览全文不难发现文章的架构组成、分析思路、数据挖掘相互独立但又层层关联。
文章开篇介绍腺枝葡萄GH6叶片的基因组测序结果，利用ONT测序、Nanopore矫正并借助Hi-C辅助组装共获得498.27Mb的基因组信息并将481.44Mb序列挂载到19条染色体中。通过基因组功能注释、基因组共线性分析、系统发育树等各项分析策略，发现腺枝葡萄在进化过程中，本文重点关注的GH6在形成过程中确实与其它葡萄品种的基因组信息存在一定差别。GH6基因组草图的绘制为接下来的GH6浆果品质研究奠定了基础；
本文除描绘GH6的基因组草图外，同时关注影响GH6浆果品质的酚类化合物组成特征。在第二部分引入了广泛靶向代谢组，筛选出在GH6中丰度更高的一些酚类化合物。
文章最后，利用转录组数据将基因组信息与代谢组信息进行关联，直接探索基因转录水平的差异对下游代谢物（酚类化合物）合成和积累的调控机制。文章一气呵成，同时完成了三个主要任务（腺枝葡萄GH6基因组测序、GH6代谢物特征、基因转录对代谢物合成的调控方式），为葡萄其它品质的遗传改良研究提供参考价值。
最后，基迪奥可提供上文提到的基因组、转录组、代谢组检测服务，配以组学数据分析团队、多组学项目技术支持团队、转录组数据挖掘培训班，让您不仅可享受专业团队数据分析，还可独立掌握数据挖掘技能，真正实现生物学意义研究全面、自主、可控。
参考文献
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